Теоретический анализ

Вопрос этот тем более существен, что теоретический анализ его привел нас к парадоксальному заключению. Наряду и в связи с этим вопросом теперь будет обсужден и вопрос о том, аккумулируются ли спонтанные повреждения ДНК в клетках млекопитающих? Или, иначе, накапливаются ли повреждения ДНК с возрастом, и если да, то какого типа?

До настоящего времени среди биологов и особенно врачей широко распространено мнение, что ДНК в клетке является стабильной структурой и поэтому с возрастом не происходит накопления в ней повреждений. Изложенные выше результаты теоретических, а ниже — экспериментальных исследований заставляют пересмотреть оба эти положения (большинство результатов будет изложено ниже).

1. В клетках головного мозга крыс протекает спонтанный репаративный синтез ДНК - Но это однозначно свидетельствует и о том, что ДНК клеток головного мозга млекопитающих постоянно подвергается повреждению. Приведенные данные получены в экспериментах с интактными животными, находившимися в нормальных условиях существования.

2. О накоплении с возрастом спонтанных повреждений ДНК можно судить по изменению скорости седиментации ДНК лизатов диплоидных фибробластов при их старении в организме. Как будет показано ниже, ДНК фибробластов, полученных из кожи 91-летнего человека, седиментирует значительно медленнее, чем ДНК фибробластов эмбрионального происхождения. Рассчитанные значения средневесовых молекулярных масс равны соответственно 4,7-108 и 5,1-108 дальтон. Наиболее вероятное объяснение этих результатов состоит в том, что при старении в ДНК накапливаются щелочелабильные участки, которые в процессе лизиса клеток в растворе при рН = 12 и центрифугировании в градиенте щелочной сахарозы трансформируются в однонитевые разрывы и тем самым приводят к снижению молекулярной массы ДНК. Одним из основных механизмов образования щелочелабильных связей ДНК является ее депуринизация. Таким образом, выщеп-ление пуриновых оснований из ДНК следует считать одним из основных физических механизмов возникновения спонтанных повреждений ДНК. С таким заключением согласуются и результаты теоретических расчетов, приводимых выше. Как показано, при физико-химических условиях, близких к физиологическим (рН = 7, 37° С), пуриновые основания выщепляются со скоростью, константа которой равна 10~10 с-1. Это означает, что за 1 сут в ДНК каждой диплоидной клетки млекопитающих возникает 10 апуриновых или щелочелабильных участков.

3. Другим механизмом спонтанного повреждения ДНК можно считать действие на нее ДНКаз клетки. О „правомочности такого представления свидетельствуют исследования, проведенные с ДНКазами клеток головного мозга крыс. В частности, нами ус -

Тановлено, что ДНКаза действительно присутствует в этих клетках, причем при старении, когда накапливаются повреждения ДНК, активность ДНКаз возрастает. Эти данные получены по стандартной биохимической методике определения ДНКазной активности. Этот же вывод был подтвержден автором и в другой серии исследований, проведенных с использованием электрофореза суперскрученной плазмидной ДНК в агарозном теле. Из этих данных следует не только, что ДНКазная активность возрастает при старении, но и то, что в клетках мозга имеется и ДНКаза, специфически деградирующая апуриновую ДНК. Последнее заключение подтверждает сделанный выше вывод о протекании в клетках процесса депуринизации ДНК.

4. Приведенные данные касались доказательства спонтанных изменений (и возможных механизмов их) первичной структуры ДНК. Метод кругового дихроизма (КД) очень чувствителен к нарушениям структуры ДНК другого рода, а именно изменениям конформации двойной спирали ДНК. ДНК, выделенная из печени и мозга молодых крыс, имеет спектры, практически идентичные спектрам КД тимуса теленка, которые, в свою очередь, по форме и амплитудам соответствуют спектрам КД ДНК тимуса теленка, опубликованным ранее другими авторами. Оптическая активность положительной и отрицательной полос спектров КД ДНК, выделенной из тканей старых животных, снижена на 20—30%, и это различие статистически достоверно.

После у-облучения растворов ДНК наблюдаются аналогичные изменения спектров КД ДНК. Есть основания полагать, что наблюдаемые нами изменения спектра КД ДНК при старении или после у-облучения ДНК не определяются образованием однонитевых разрывов в ДНК, а обусловлены разрушением оснований или переходом модифицированных участков ДНК из канонической В-формы в иную конформацию, причем эти конформационные изменения отличаются от ранее изученных денатурационных изменений ДНК, индуцированных излучением.