» » Скорость дезаминирования цитозина
Скорость дезаминирования цитозина

При физиологических значениях рН и температуры скорость дезаминирования цитозина пока не удалось измерить. Поэтому оценку этой скорости приходится делать методом экстраполяции на основании данных о скоростях дезаминирования цитозина при высоких температурах. Константа скорости дезаминирования дезо-ксицитозинмонофосфата (dCMP) и цитозиновы. х остатков в одно-цепочечной ДНК при 95° С и рН = 7,4 равна 2-10~7 с-1, а энергия активации этого процесса 29 ккалмоль. Подобные значения получаются и при использовании данных из. Однако в нативной ДНК скорость спонтанного дезаминирования цитозина, вероятно, значительно меньше. Так, скорость дезаминирования цитозина в нативной ДНК из E. coli при 70° С составляла при той же температуре менее 1% соответствующей скорости для поли. Согласно оценкам Бальца, в расчете на ДНК диплоидной клетки человека, содержащей, по его оценкам, 1,4-109G:C пар, в течение суток дезаминируется примерно 100 цитозинов. Однако, как показано выше, в ДНК диплоидной клетки человека содержится 7 -109 пар оснований, т. е. не 1,4-109 пар G:C, а примерно 3,5-109 пар оснований. Следовательно, в течение суток дезаминируется не 100, а примерно 250 цитозинов.

Значение вторичной структуры нуклеиновых кислот как фактора, увеличивающего химическую устойчивость их компонентов, следует из опытов с тРНК. Остатки цитозинов доступны для реакции с анионами бисульфита только в том случае, если они расположены в «петлях» тРНК. Рассматриваемое значение вторичной структуры ДНК и РНК, вероятно, определяется тем, что атакующий ДНК реагент должен быть соответствующим образом сориентирован. Действительно, линейные водородные связи между группами ДНК, содержащими обмениваемые протоны, и акцепторами протонов, растворенными в воде, могут быть образованы лишь при расположении их в плоскости оснований. Нуклеофильная же атака цитозиновых остатков (ионом гидроокиси в положении С-4 или ионом бисульфита в положении С-6) должна осуществляться перпендикулярно плоскости оснований. Но такая атака может быть затруднена из-за стэкинга оснований, расположенных копланарно к протонированным остаткам цитозина. В полностью нативной двойной спирали полинуклеотида атака нуклеофила перпендикулярно протонированному основанию может быть невозможна. Однако нарушение структуры отдельных участков ДНК должно сделать их основания, в частности протонированные остатки цитозина, более доступными для реакций. Вместе с тем если нуклеофильная атака перпендикулярно плоскости кольца произойдет, то планзрность пиримидинового кольца будет нарушена, и это уменьшит стэкинг-взаимодействие.

Есть основания полагать, что, наряду со стерическими препятствиями, обусловленными в основном взаимодействием между л-электронами соседних оснований, есть другой основной фактор, уменьшающий реакционную способность протониро-ванных остатков цитозина в ДНК по сравнению с его протонированными производными в растворе. Поэтому энергия активации для нуклеофильной атаки прото-нированного цитозина в ДНК может составлять 37 ккалмоль и более, для цитозина в мономерном состоянии она равна 29 ккалмоль. (Предполагается исходя из того, что стэкинг-взаимодействия составляют от 5 до 8 ккалмоль.)

Таким образом, хотя цитозиновые остатки в ДНК эффективно защищены от нуклеофильной атаки молекулами воды и другими нуклеофилами, такая защита не является 100%-ной. Кроме того, есть основания полагать, что условия, при которых ДНК находится in vivo, могут увеличивать уязвимость цитозиновых остатков к гидролитическому дезаминированию.

Другой путь изменения ДНК — замещение тимина ДНК ураци-лом, включение дезоксиуридина в ДНК. Частота такого включения резко возрастает при обработке клеток такими антиметаболитами, как антифолаты, или изменениях функций определенных ферментов, регулирующих пул нуклеотидов. Частота таких ошибок довольно высока. Об этом, в частности, свидетельствует тот факт, что активность гликозилазы, катализирующей выщепление урацила из ДНК, максимальна в период репликации ДНК, в период S-фазы клеточного цикла, и этот максимум предшествует максимуму интенсивности синтеза ДНК.

Известны двойные dut-мутанты кишечной палочки, в которых до 20% тимина в ДНК замещено на урацил. Одна из этих мутаций нарушает метаболизм предшественников ДНК, а также резко снижает активность сШТРазы, разрушающей dUTP, а другая — активность урацил-ДНК-гликозилазы, выщепляющей урацил из ДНК. При таком взаимодействии мутаций наблюдался синер! изм, так как при одной мутации dut или ung степень замещения тимина урацилом составляла менее 0,5%.

Воздействия, нарушающие метаболизм фолиевой кислоты (антифолаты), нарушают «правильное» соотношение концентраций нуклеотидов в клетках млекопитающих. Такой дисбаланс приводит к увеличению включения dUMP в ДНК и к образованию в ней щелочелабильных связей, вероятно, вследствие функционирования ферментов пострепликативной эксцизии. В нормальных клетках пул dUMP и dUTP равен соответственно 0,85ХЮ-9 М и менее 3-101Л М в расчете на 106 клеток.