» » Накопление в ДНК исследованных модификаций
Накопление в ДНК исследованных модификаций

К сожалению, Шарма и Ямамото не исследовали вопрос о том, не приводит ли накопление в ДНК исследованных ими модификаций к образованию в модифицированных участках щелочелабильных связей хотя первое сообщение о результатах наших исследований возрастных изменений ДНК, сходных с радиационными, было опубликовано за 2 года до появления в печати работы.

Другого типа изменения структуры ДНК накапливаются в измеримых количествах лишь в ДНК клеток старых организмов. Переход отдельных участков двуспиральной ДНК из канонической в Z-конформацию — один из примеров такого процесса относительно медленного накопления изменений ДНК с возрастом, причем и такие изменения оказываются сходными с теми, которые индуцируются ионизирующим излучением.

Для проверки проведенных в гл. 2 теоретических оценок скорости образования тепловых (спонтанных) повреждений ДНК, а также скорости образования щелочелабильных связей (апуриновых) участков и разрывов ДНК также был использован усовершенствованный нами метод седиментации ДНК лизатов фибробластов человека.

Данные о повышенной чувствительности опухолевых клеток к теплу стимулировали интенсивное исследование тепловых эффектов на клетки млекопитающих. Обычно полагают, что белки и мембраны являются важными или даже критическими мишенями при повреждающем действии гипертермии. Но имеется мало данных о влиянии прогревания клеток человека на их ДНК. В нескольких исследованиях, проведенных на культивируемых клетках грызунов, не было обнаружено образования в ДНК разрывов (или других щелочелабильных участков, например апуриновых), и было заключено, что прогревание клеток млекопитающих при температурах не выше 45° С не повреждает их ДНК - В то же время теоретические расчеты свидетельствуют о том, что даже при физиологической температуре в клетке должен протекать интенсивный процесс депуринизации ДНК, причем скорость его резко зависит от температуры. Исследование этого вопроса представляло интерес и в плане механизмов действия гипертермии на клетки, так как можно было предположить, что образование в ДНК апуриновых участков и других термоповреждений является одним из молекулярных механизмов воздействия умеренного прогревания на клетки, в частности индукции хромосомных аберраций и летальных эффектов.

Методом ультрацентрифугирования в градиенте щелочной сахарозы изучили влияние умеренного прогревания (30 мин при 44 или 43,5°) нормальных фибробластов человека (как эмбриональных так и полученных от взрослых доноров) на структуру их ДНК. Известно, что в щелочном градиенте все апуриновые участки превращаются в однонитевые разрывы, поэтому использованный метод исследования позволял оценивать суммарное число имеющихся в ДНК апуриновых сайтов и однонитевых разрывов. Температура 44 и 43,5° С была выбрана, во-первых, потому, что в этих условиях эффективность воздействия гипертермии на клетки высока, но не настолько, чтобы вызвать гибель значительной части клеточной популяции, а, во-вторых, именно этот температурный интервал представлял интерес для дальнейших сравнительных исследований нормальных и опухолевых клеток, ибо при таких температурах разница в скорости гибели этих клеток, вероятно, максимальна.

Бионсию, культивирование диплоидных фибробластов и анализ их карио-типа проводили по общепринятой методике на культивируемых диплоидных фибробластных эмбрионального происхождения, полученных из института медицинской генетики АМН СНГ и фибробластов взрослых людей различного возраста. При пассировании клетки пересевали в отношении 1:2. Ростовая среда состояла из 50% среды Игла, 30% гидролизата лактальбумина и 20% сыворотки крупного рогатого скота. Прогревали клетки в виде суспензии в ультратермостате при 44 или 43,5±0,1° С. ДНК клеток метили, инкубируя их в среде, содержащей 1 мкКимл 3Н-тимидина.

Седиментационный анализ ДНК проводили по методу Мак-Грасс и Уильямса в нашей модификации. За сутки до опыта среду в культивационных флаконах заменяли на нерадиоактивную. По 0,5 мл суспензии клеток, снятых со стекла 0,25%-ным раствором трипсина, помещали в две пробирки, одну из которых прогревали в течение 30 мин в ультратермостате.