Новые подходы

Таким образом, намечаются новые подходы к исследованию механизмов спонтанных и индуцированных излучением изменений структуры ДНК. Биологическая значимостыэтих изменений должна быть весьма существенной, если учесть решающее значение повреждений ДНК в радиационном поражении и старении млекопитающих.

При исследовании способности ДНК акцептировать метильные группы в реакции гетероготического метилирования ДНК печени крыс тех же возрастов, которые были использованы при изучении КД ДНК, мы обнаружили сходные закономерности. Хотя при старении и после облучения эта способность уменьшается, радиочувствительность ДНК старых крыс по рассматриваемому параметру не больше, чем радиочувствительность молодых крыс.

Изучали ДНК печени и мозга четырех молодых (в возрасте 1 мес) и трех старых (в возрасте 38 мес) крыс линии Вистар. ДНК с молекулярной массой около 107 выделяли из печени и мозга крыс модифицированным методам Кея и др. ДНК-метилаза Eco RII (M. EcoRII) была любезно предоставлена профессором Я. И. Бурьяновым и выделена им и его соавторами из клеток E. coli В834. Реакцию метилирования исследованных препаратов ДНК проводили в реакционной среде следующего состава: 40 ммоль трис-HCl (рН-7,5), 5 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 5 10—6 М S-аденозил-Ь-метионина (метил-3Н) (Атег-sham, Англия), 20 мгк ДНК и 200 ед. ДНК метилазы, объем 100 мкл. Реакцию проводили при 37° С. Через 5 ч ее останавливали, пробы переносили на фильтры и считали радиоактивность. Количество метильных групп, включенных в ДНК, определяли исходя из удельной радиоактивности S-аденозилметионина и эффективности счета трития. Препараты ДНК облучали на гамма-установке РХ 60Со (мощность излучения 47 Грмин) при 20° С.

В табл. 4 систематизированы данные возрастных и индуцированных излучением различий ДНК печени в степени ее гетерологи-ческого метилирования. Как видно из полученных данных, во всех опытах наблюдается уменьшение акцепторной способности ДНК старых животных по сравнению с ДНК молодых животных и ДНК, облученной в растворе, по сравнению с необлученной ДНК, причем метилируемость ДНК после облучения уменьшается симбатно с увеличением дозы облучения.

При исследовании фракции двунитевой ДНК в мозжечке крыс различного возраста после действия ионизирующего излучения было обнаружено, что возрастная зависимость является функцией промежутка времени между облучением и измерением повреждений ДНК. Если такое измерение проводили через 1 ч после облучения, то число регистрируемых повреждений не зависело от возраста животных (в течение первых двух недель после рождения). Однако если исследование проводили на ДНК через 4 ч после облучения, то число регистрируемых повреждений возрастало по мере увеличения возраста животных от 5 до 13 сут. Кроме того, даже у крысят в возрасте 1—5 сут число повреждений, определяемых через 4 ч после облучения, было не меньше, а больше, чем через 1 ч после облучения. Оба факта можно связать, предположив, что наряду с репарацией ДНК в течение первых часов после облучения происходит также деградация ДНК, причем последний процесс активируется у крысят на 2-й неделе их жизни после рождения. Именно в этот период жизни крысят мы наблюдали большую нестабильность ДНК в клетках головного мозга крыс, что проявлялось по резкому уменьшению радиоактивности ДНК, обусловленной предварительным включением в нее меченого тимидина. Таким образом, увеличенная спонтанная нестабильность ДНК клеток головного мозга крысят в возрасте 1—2 нед может быть причиной увеличенной нестабильности их ДНК и после облучения. Во всяком случае, можно полагать, что существуют сходные механизмы «спонтанной» и индуцированной излучением деградации ДНК.