16 фракций

После этого содержимое каждой пробирки наслаивали на градиент 5—20%-ной щелочной сахарозы (0,1 М NaOH + + 0,9 М NaCl+0,003 М Na2 ЭДТА; объем 30 мл), куда предварительно наносили 1,5 мл лизирующего раствора (0,5 М NaOH + 0,1 М Na2 ЭДТА + 0,2% додецил-сульфата Na). Лизис клеток и денатурация ДНК происходили непосредственно на градиенте в течение 10 ч при комнатной температуре в темноте. После этого градиенты центрифигуровали в течение 7,5 ч (20° С, 12 500 обмин) на центрифуге VAC-601 (ГДР) в бакет-роторе 3X35 мл.

После центрифугирования градиенты разделяли на 16 фракций, начиная со дна пробирки. ДНК полученных фракций осаждали 10%-ной трихлоруксусной кислотой, наносили на фильтры 3 ммоль и промывали их трихлоруксусной кислотой и этиловым спиртом. Радиоактивность фильтров определяли на сцинтилляционных счетчиках «Intertechnique SI-ЗО» или «Весктап LS-355».

В систематизированы результаты проведенных таким образом многих наших экспериментов по влиянию прогревания при 44° С культивируемых нормальных и опухолевых клеток на структуру их ДНК. Во всех опытах наблюдали смещение седиментограмм вправо, что свидетельствовало о деграции ДНК. Для каждой из седиментограмм рассчитывали следующий параметр: где А — первый момент распределения ДНК по молекулярной массе; xi — номер фракции, а с-ь — радиоактивность этой фракции, % суммарной активности. Самую верхнюю 16-ю фракцию в расчет не принимали. Первый момент распределения характеризует среднее значение коэффициента константы седиментации ДНК исследуемых клеток 5, отн. ед.

Кроме того, для нескольких седиментограмм были рассчитаны значения средневесовой молекулярной массы ДНК (Mw) фибробластов. Эти расчеты проводили по формуле, выведенной исходя из зависимости константы седиментации ДНК каждой фракции 5 от молекулярной массы Mi этой фракции и соотношения между Si и расстоянием di, прошедшим молекулой ДНК за время при скорости центрифугирования.

Калибровочную константу К градиента определяли с помощью меченой ДНК фага А, Ь2, с учетом того, что денатурированная ДНК фага имеет молекулярную массу 1,35-107. Применимость уравнения для расчета молекулярной массы ДНК животных клеток строго не доказана, и выведено оно для ДНК с молекулярной массой меньшей 108. Однако есть основания полагать, что при применении этой формулы для оценки молекулярной массы ДНК клеток человека грубой ошибки не допускается. При определении различий в величине первого момента распределения ДНК контрольных и прогретых клеток статистический анализ проводили с использованием теста для малых выборок.

В табл. 3 суммированы данные опытов, проведенных на клетках трех эмбриональных штаммов. Исходя из значений Mw, можно рассчитать среднечисленные молекулярные массы (Мп) ДНК контрольных и прогретых клеток, приняв, наряду с другими авторами, что для ДНК клеток млекопитающих справедливо соотношение Mn — 0,5Mw. На основании этих данных можно определить число индуцированных в ДНК разрывов (N) по формуле где N — число разрывов в расчете на определенное количество ДНК (Мс) в клетках млекопитающих в единицах массы. В фибробластах кожи взрослых людей также наблюдали уменьшение Mw ДНК после прогревания, как и в эмбриональных клетках. Однако этот эффект был менее выражен, чем в опытах с эмбриональными фибробластами.

Полученные данные позволяют полагать, что прогревание фибробластов человека при 44° С в течение 30 мин приводит к повреждению их ДНК. Так как величина этого повреждения у клеток людей различного возраста и даже у отдельных людей может быть неодинаковой, то представляется возможным определить лишь порядок этой величины, и в расчете на геном диплоидной клетки человека она оказывается равной порядка 103 повреждений.

Неожиданным результатом проведенных экспериментов является установление факта увеличения средневесовой молекулярной массы ДНК фибробластов, подвергнутых умеренному прогреванию при 43,5° С. В то же время на основании теоретических предпосылок следовало ожидать снижения под влиянием умеренной гипертермии молекулярной массы ДНК изучаемых клеток вследствие тепловой деградации ДНК - Надо принять во внимание, что этот эффект может перекрываться одним из следующих процессов: 1) образованием сшивок ДНК--белок или ДНК - ДНК 2) активацией систем, репарирующих спонтанные повреждения ДНК, накопившихся в клетке до прогревания.