Положение ДНК фага

В результате после облучения седиментаграмма сдвигается вправо. Точно такой эффект виден на 2 при сравнении седиментограмм ДНК фибробластов старого человека с ДНК фибробластов эмбрионального происхождения. Зная положение ДНК фага с известной молекулярной массой, можно рассчитать молекулярные массы ДНК исследованных клеток. Они равны для ДНК эмбриональных фибробластов 5,12-108, а для фибробластов старого донора 4,7-108. Это различие небольшое, но результаты повторных опытов, поставленных с ДНК лизатов фибробластов двух штаммов, позволяют считать уменьшение молекулярной массы ДНК в клетках старого человека статистически достоверным. Это различие соответствует накоплению в ДНК клеток 91-летнего человека нескольких тысяч однонитевых разрывов.

При интерпретации этих данных нужно учесть, что из ДНК с большой частотой выщепляются (спонтанно или после предварительного алкилирования) пуриновые основания. Часть апуриновых участков, вероятно, не может быть репарирована вследствие недоступности их для репарирующих ферментов. Иными словами, с возрастом неизбежно должны накапливаться апуриновые участки. Известно, что апуриновые участки очень чувствительны к щелочи. Спонтанная модификация сахарного остатка ДНК или алкилирование ее фосфатных групп, чувствительных к щелочи, также может быть причиной накопления с возрастом в ДНК щелочелабильных связей. Таким образом, обнаруживаемое возрастное уменьшение скорости седиментации ДНК клеток человека должно быть обусловлено накоплением в ДНК как однонитевых разрывов, так и щелочелабильных участков, реализуемых в такие повреждения в процессе лизиса клеток и центрифигурирования лизатов. В последние годы другими авторами также методом седиментации в градиенте щелочной сахарозы обнаружены аналогичные возрастные изменения ДНК клеток собак и грызунов.

При старении клеток в процессе их культивирования (по мере увеличения числа пассажей) уменьшение скорости седиментации ДНК обнаружено лишь на культурах последних пассажей, уже вступивших в фазу деградации. Эти данные подтверждены в нескольких лабораториях. Количество щелочела-бильных связей в ДНК возрастало и в том случае, если клетки находились в сомкнутом монослое в течение 2—3 сут. Однако такое возрастание достоверно лишь в культурах эмбриональных фибробластов, но не фибробластов взрослых доноров.

Таким образом, хотя метод седиментации в градиенте щелочной сахарозы нельзя считать свободным от артефактов, обнаруживаемые с его помощью возрастные изменения ДНК в совокупности с данными, полученными другими щадящими методами анализа, можно с большой вероятностью интерпретировать как доказательство накопления с возрастом в ДНК однонитевых разрывов и щелочелабильных связей (апуриновых участков, алкилированных фосфатных групп и т. д.). Следовательно, этот метод при соблюдении необходимых условий эксперимента может быть весьма ценен при исследовании изменений первичной структуры ДНК. Сказанное об оптимальных условиях исследования ДНК методом седиментации в градиенте сахарозы верно не только в отношении оценки степени повреждения ДНК, но и в отношении исследования скорости повреждений, индуцированных различными факторами. Кроме того, при исследовании репарации ДНК возможны артефакты, связанные с повреждением клеток в процессе их снятия со стекла. Устранить их можно с помощью несложного приспособления, позволяющего лизировать клетки на градиенте, не снимая клеток с покровных стеклышек, на которых они были выращены перед опытом. Подробнее этот методический прием описан в. С его помощью получено доказательство сходного изменения седиментограмм ДНК лизатов фибробластов при их старении или у-облучении.

Изменения ДНК в клетках, полученных от старых людей, а также в клетках культур последних пассажей не были теоретически неожиданными. Однако теоретически непредсказуемый результат был получен при сравнении ДНК диплоидных фибробластов эмбрионального происхождения и ДНК фибробластов, полученных из кожи молодых, здоровых доноров.

Можно утверждать, что при старении клеток и in vitro, и in vivo в их ДНК накапливаются щелочелабильные связи. Особенностью диплоидных фибробластов является то, что их митотиче-ский потенциал начинает уменьшаться начиная с периода эмбрионального развития.