ДНК с ферментом

При инкубации ДНК с ферментом в течение 1 ч акцепторная способность ДНК старых крыс составляла 63% способности ДНК молодых животных. Примерно таковым было соотношение активностей ДНК при инкубации ее в тех же условиях с ДНК-метилазой в течение 7 ч, хотя в случае инкубации в течение 5 ч соотношение составляло 80%. Подробнее эти данные и результаты исследования дозовой зависимости изменения ДНК после облучения приведены в гл." 7. Сходство характера изменения способности акцептировать метильные группы ДНК, полученной из органов старых животных, с изменениями, наблюдаемыми после у-облучения ДНК, согласуется с результатами исследования нами методом кругового дихроизма (КД) ДНК, выделенной из печени и мозга молодых и старых крыс, а также ДНК после у-облучения.

Этот подход к исследованию спонтанных повреждений ДНК также основан на сделанном исходя из термодинамического анализа, заключении о том, что репарация спонтанных повреждений не может протекать со 100%-ной эффективностью. Часть повреждений неизбежно избегает «систем репарации ДНК», и, таким образом, с возрастом повреждения ДНК должны аккумулироваться. Этот процесс в чистом виде или особенно отчетливо может протекать также только в неделящихся клетках.

Спонтанные и индуцированные излучениями изменения конформации ДНК: доказательство методом КД сходства возрастных и индуцируемых у-облучением изменений вторичной структуры ДНК.

Все сказанное выше касалось нестабильности первичной структуры ДНК. Но имеет ли биологическое значение нестабильность вторичной структуры ДНК? Казалось бы, этот вопрос не имеет смысла. Известно, что переход ДНК из нативной формы в денатурированное состояние происходит при температурах, намного превышающих физиологические температуры. Однако при таком рассмотрении нестабильности структуры ДНК имеют в виду расплетание и денатурацию двойной спирали всей молекулы ДНК. Но в двойной спирали нуклеиновой кислоты возможно образование денатура-ционных участков (петель) длиной несколько пар нуклеотидов. Частота возникновения таких участков даже при физиологических температурах велика. Такие изменения должны также сопровождать химические спонтанные модификации ДНК и образование в ней разрывов фосфодиэфирных связей.

Метод КД можно отнести к числу наиболее чувствительных методов исследования вторичной структуры ДНК - Нами было обнаружено, что спектры КД ДНК, выделенной из печени и мозга 38-месячных крыс, значительно отличаются от спектров КД ДНК из тех же органов 1-месячных животных.

Одна из основных особенностей биологических изменений при старении состоит в том, что они развиваются постепенно и носят кумулятивный характер. Поэтому мы сравнивали ДНК, изолированную из тканей молодых (в возрасте около месяца) крыс линии Вистар с ДНК, выделенной из аналогичных тканей очень старых крыс (возраст 38 мес) той же линии, т. е. в возрасте, близком к максимальной видовой продолжительности жизни белых крыс. Опыты были поставлены на четырех крысах этого возраста и четырех молодых крысах. Старые крысы были выращены в виварии Института биологической физики АН СНГ при стандартных условиях содержания.

ДНК с молекулярной массой около 107 выделяли из печени и мозга крыс модифицированным методом Кея и др. Содержание белка в препаратах ДНК было менее 1%. Перед исследованием препараты обрабатывали панкреатической РНКазой. Спектры КД регистрировали на спектрополяриметре J-20 (Япония) при. концентрации ДНК 0,004—0,006%. В этой области концентраций значения молярной эллиптичности ДНК и определяемая по ее изменению радиочувствительность не зависели от концентрации ДНК - Препараты ДНК облучали в 0,15 М NaCl на гамма-установке РХ Со60 (мощность излучения 47 Грмин). Облучение ДНК и регистрацию спектров КД проводили при 20° С. Определяли величину молярного дихроизма или молекулярную эллиптичность (разница молярных коэффициентов экстинкции для света, поляризованного по кругу влево и вправо) по формуле (14): [9] =3300 X X(l — ?)), где eL и eD — молекулярные коэффициенты поглощения.

На 3 приведены спектры КД необлученных препаратов ДНК, выделенной из печени и головного мозга молодых и старых крыс. Для сравнения приведен спектр КД ДНК тимуса теленка, выделенной и исследованной нами в тех же условиях, что и ДНК из тканей крыс. Ранее при исследовании ДНК млекопитающих методом КД использовали именно ДНК тимуса.