Близкие изменения

5. Близкие изменения происходят и при метилировании ДНК. Поэтому было предположено, что с возрастом происходит «дополнительное» метилирование ДНК. Это предположение согласуется с данными, полученными при исследовании гетерологичного метилирования ДНК печени 1-месячных и 38-месячных крыс ДНКме-тилазой EcoRII. Обнаружено, что акцепторная способность у ДНК печени старых животных на 30% меньше, чем у ДНК, выделенной из печени молодых животных.

Рассмотренными механизмами не исчерпываются механизмы спонтанных модификаций ДНК. Об этом свидетельствуют результаты, полученные при исследовании ДНК 6-месячных и 27-месячных крыс на ротационном эластовискозиметре (работа проведена в 1979 г. в лаборатории С. Е. Бреслера). Обнаружено, что время ретардии ДНК молодых животных равно 849=ь87 с, а ДНК старых крыс 1420+165 с. Возрастные изменения, свидетельствующие об изменении эластовязкостных свойств ДНК, сходны с теми, которые индуцируются в ДНК при действии на животных ионизирующего излучения в сублетальных дозах.

Теперь подробнее рассмотрим данные о сходстве спонтанных и индуцированных ионизирующим излучением повреждений ДНК, полученных нами двумя методами: седиментации в градиенте щелочной сахарозы и кругового дихроизма.

На рис 2 приведены седиментограммы ДНК лизатов эмбриональных фибробластов и фибробластов, полученных из кожи 91-летней женщины. На 2 указаны значения средне-весовых молекулярных масс, рассчитанных с помощью ДНК фага М. Молекулярная масса этой ДНК известна, а положение ее в градиенте, использованном при исследовании ДНК клеток человека, указано на 2 стрелкой. Клетки культур фибробластов были исследованы цитогенетическими методами в Институте медицинской генетики АМН СНГ К. Н. Гринбергом. Хромосомных изменений в клетках не было найдено. Культуры «взрослых» и «старых» фибробластов получали методом биопсии с передней поверхности кожи предплечья здоровых доноров. Клетки кожи 91-летней женщины были получены в Институте геронтологии АМН СНГ (Киев) от пациентки, у которой не было найдено резких патологических изменений. Исследовали культуры, находящиеся в фазе II (по Хейфлику), т. е. не вступившие в фазу дегенерации.

Для устранения артефактов, связанных с возможным образованием однони-тевых разрывов в фазу репликации ДНК, использовали только культуры клеток, находящиеся в состоянии сомкнутого монослоя, когда вследствие контактного торможения митотическая активность клеток прекращалась. Кроме того, чтобы исключить образование в ДНК меченых частично реплицированных репликонов, за 24 ч до снятия клеток со стекла среду их роста заменяли на свежую, не содержащую меченого тимидина. Далее, на линейный 5—20%-ный градиент сахарозы, содержащий 0,9 М NaCl, 0,1 М NaOH, 0,003 М ЭДТА (общий объем градиента 30 мл), осторожно наслаивали 1,5 мл лизирующего раствора, содержащего 0,5 М NaOH, 0,1 М ЭДТА и 0,2% SDS. Чтобы исключить преципитацию SDS в лизирующем растворе, его добавляли после предварительного прогревания в растворе при 37° С; сразу же на градиент наносили суспензию клеток (около 105 в 0,5 мл). Лизис клеток и денатурацию ДНК проводили в темноте в течение 12 ч при 20° С. Затем градиенты центрифугировали в течение 7,5 ч при 20° С в центрифуге VAC-601 при 12 500 оборотах. Градиент разделяли на 16 фракций, считая со дна центрифужной пробирки. Самую верхнюю фракцию при построении седиментограмм на основании данных о радиоактивности каждой фракции не учитывали.

Аналогичные опыты ставили с ДНК клеток после у-облучения в различных дозах. Результаты этих опытов не приведены, так как хорошо известно, что после облучения на седиментограммах наблюдают уменьшение радиоактивности ДНК во фракциях с относительно большой молекулярной массой и увеличение содержания ДНК во фракциях с небольшой молекулярной массой.